給水管道生物膜中的細菌生長研究

于水利*　 余鑫晶　 邱曉霞
Yu Shuili　 Yu Xinjing　 Qiu Xiaoxia

（哈爾濱工業大學市政環境工程學院 150090）
（School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，P.R.China，150090）

摘要：近年來，人們越來越關注飲用水在管道中的二次污染問題，并提出了飲用水質的生物穩定性概念。本文用生物學方法分析了給水管網生物膜中細菌的種群生長情況。PCR擴增、凝膠電泳試驗檢測結果表明，試驗管道和哈爾濱自來水管道生物膜中不含銅綠假單胞菌。從拍攝的掃描電鏡可以看出，附著在管壁上的微生物多為球菌和桿菌。從模型管網分離出20株菌，其中玫瑰色微球菌、藤黃微球菌、地桿菌屬、擴展短桿菌、節桿菌屬是模型管道試驗的優勢菌。輸送同一水質的哈爾濱市實際管網管壁生物膜中的細菌種類與模型管道中的類似。

關鍵詞：飲用水生物穩定性、優勢菌種、分菌、PCR擴增、銅綠假單胞菌

Abstract: The recontamination during distribution of drinking water has been receiving considerable attention these years. Microbiological method wad used to analyze the population of the biofilms. Pseudomonas aeruginosa was not found in the biofilms by the PCR amplification and agarose gel eletrophoresis. According to the scanning electron microscopic photos, most microorganisms attached inside pipelines were found to be cocci and bacilli. 20 bacteria strains were obtained. For the model pipeline, the dominant species living throughout the test periods were Micrococcus Roseus, Micrococcus luteus, Terrabacter Collins, Brevibacterium linens and Arthrobacter. The strains of the actual pipeline was similar with the model pipeline.

Key words: Biostability of drinking water, Dominant species, Isolation, PCR reactions, Pseudomonas aeruginosa.

0 前言

　　近年來，人們越來越關注飲用水在管道中的二次污染問題，并提出了飲用水質的生物穩定性概念。飲用水生物穩定性（biological stability of drinking water）是指飲用水中可生物降解有機物支持異養菌生長的潛力，即當有機物成為異養菌生長的限制因素時，水中有機營養物支持細菌生長的最大可能性。飲用水生物穩定性高，表明水中細菌生長所需的有機營養物質含量低，細菌不易在其中生長；反之，飲用水生物穩定性低，則表明水中細菌生長所需的有機營養物質含量高，細菌容易在其中生長^[1]。
　　 研究控制給水管網中細菌再生長成為提高水質生物穩[3]定性的關鍵。本文采用生物學方法，對給水管網管壁中形成的生物膜進行分菌、純化試驗，分析生物膜中的細菌生長情況，找出給水管道生物膜中的優勢菌，尋找從根本上提高飲用水管道的生物穩定性的方法。由于傳統的細菌分菌方法具有一些局限性，難以保證分離一些量少或不容易存活的細菌，本文用分子生物學方法，檢測某些病原菌或有特定研究意義的菌種。文獻[2]曾報導在飲用水中發現銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）的存在，它是一種機會致病菌，對人體會產生一定的危害。因此，本文嘗試用PCR（聚合酶鏈反應）擴增及凝膠電泳的方法來檢測給水管網生物膜中是否有銅綠假單胞菌的存在。PCR擴增檢測具有快速準確的優點，可以推廣應用于檢測水中病原菌的試驗中。

1 試驗設備與方法

1.1 試驗設備
　　管道生物膜在一個實驗室管道模型中培養，管道長0.4m，內徑150mm，模型的示意圖見圖1。管道材質采用鑄鐵管，管上有6個取樣口，用套有相同鑄鐵片的螺栓擰在模型上，鑄鐵片即為模擬的管壁，在其上培養生物膜。
　　 該模型連接在自來水管道上，自來水的水質情況如表1所示。

實驗室自來水水質（哈爾濱市）　　　　　　　　 表1

　　模型從2004年3月起開始運行，于2004年7月（培養4個月）、11月（培養8個月）與2005年3月（培養12個月）分別取樣進行分菌純化鑒定試驗。另外于2005年5月對實際管網（檢修時）取樣進行分菌純化鑒定分析。

圖1實驗室管道模型示意圖

1.2 試驗方法
1.2.1 分菌
　　取樣：無菌操作，用一小團滅菌的脫脂棉輕輕擦拭在鑄鐵片上形成的生物膜，立即投入盛有100ml無菌水的錐形瓶中，塞上棉塞，用力震蕩約15分鐘，使脫脂棉上的菌膠團充分打散。
　　增菌：對水樣用牛肉膏蛋白胨培養液分別作好氧菌和厭氧菌的增菌培養，好氧30℃，48小時，厭氧30℃，4天。模型管網的第三批水樣進行了增菌處理，同時也作了不增菌的平行樣，之后進行分菌。
　　分菌：取增菌后的培養液進行逐倍稀釋，用涂布與混合法在固體培養基中培養菌落，30℃培養1~7天，對長出的不同菌落進行劃線分離。
　　純化：對分離出的菌落進行多次劃線分離純化，劃線4~5次后基本可以確定為純菌，將純菌轉移到斜面平板上保存并分析。
　　鑒定：細菌鑒定按文獻[3]所描述的水中常見細菌的生理生化鑒定方法，從以下幾個主要生化特性對細菌進行鑒定：革蘭氏染色；淀粉水解；接觸酶試驗；產吲哚；產硫化氫；硝酸鹽還原；葡萄糖發酵；V.P和需氧性。鑒定依據《伯杰細菌鑒定手冊》^[4]和《常見細菌系統鑒定手冊》^[5]?！恫芗毦b定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》對細菌的形態、生理生化特性和營養需求等均有詳細的描述，是細菌分類鑒定的重要參考書。
1.2.2 電子顯微技術
　　對分離出的幾個菌種拍攝透射電鏡，以便更好的觀察菌種的形狀。
　　對管道生物膜拍攝掃描電鏡，以便直觀的觀察生物膜的生長狀況。
1.2.3 PCR擴增
　　聚合酶鏈反應（PCR）是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。該方法一改傳統的分子克隆技術的模式，不通過活細胞，操作簡便，在數小時內可使幾個拷貝的模版序列甚至一個DNA分子擴增10⁷~10⁸倍，大大提高了DNA的得率。作為檢測手段的PCR技術，成敗的關鍵在于選擇合適的靶序列，使其產物具有所需要的特異性，而其產物能否具有特異性，又取決于引物的設計。不同的試驗所需要擴增的DNA片段也可能不同，因此設計的引物也不一定相同。
　　目前已經有很多用PCR檢測銅綠假單胞菌的實例，臨床醫學應用相對較多。K.P.Song^[6]用外毒素A（ETA）特異引物進行PCR擴增，對眼科疾病患者檢測是否受到銅綠假單胞菌的感染；Ferenc Karpati^[7] 用PCR對部分16S rRNA序列進行擴增，檢測患囊腫性纖維化的病人受到銅綠假單胞菌的感染；Gareth Lloyd-Jones^[8] 用熒光PCR對新西蘭的土壤中的銅綠假單胞菌進行量化分析；Nicola M.Kingsford^[9]用PCR對部分16S rRNA序列進行擴增，檢測出羊毛廢水含有銅綠假單胞菌。由于銅綠假單胞菌的ETA基因是唯一的，且在所有的銅綠假單胞菌菌株中均能存在，具有很強的專屬性。因此本次實驗也采用文獻[6]中的引物，由上?；瞪镉邢薰竞铣?，引物序列如下：

1, 5 -GAC AAC GCC CTC AGC ATC ACC AGC-3

2, 5 -CGC TGG CCC ATT CGC TCC AGC GCT-3

　　實驗設計了5個樣，T為銅綠假單胞菌純菌培養液，R1、R2為實際管網水樣，M1、M2為模型管網水樣。其中R1、R2、M1、M2水樣取法同分菌試驗，再用牛肉膏蛋白胨培養液在35℃下富集48小時（銅綠假單胞菌在該富集培養液中能夠很好的生存繁殖），為避免培養液中因目標菌株量少而導致DNA提取失敗，本實驗直接用培養液進行PCR擴增與凝膠電泳實驗。PCR擴增體系如下：
　　總體積：12.5ul；EXtag：0.2ul（5U/ul）；10x PCR buffer（含鎂離子）：1.25ul；2.5m M的DNTP：1ul；Primer：0.25ul（each,20m M）；菌液：1ul；DdH₂O：8.55ul。PCR反應條件如下：（a）預變性：95℃下，18min；（b）三溫循環法：95℃下，15s，54℃下，1min，72℃下，1min，進行35個循環；（c）結束：72℃下，10min。電泳所用的膠為瓊脂糖凝膠（1%），EB染色。

2 結果與分析

2.1 試驗結果
2.1.1 分菌結果
　　本次試驗發現，模型管網三次分菌純化鑒定試驗共得到20種不同的菌株，對三次試驗依次編號1、2、3，其中樣3平行增菌的水樣編號3’，實際管網分菌試驗編號4，試驗結果見表2。各個菌株的部分生理生化結果見表3，其他幾項生理生化試驗結果差別不大并對鑒定沒有決定性的作用，只作為鑒定的參考，因此并未列出。
　　從鑒定結果不難看出，從給水管壁生物膜中分離出的細菌均為化能異養菌，多為革蘭氏陽性菌，好氧或者兼性厭氧且桿菌較多。由于傳統的生理生化試驗考察的菌株特性有限，所以部分菌株只能鑒定到屬，如果要進一步作準確地鑒定，可以結合PCR擴增、DNA測序等較新的技術進行測定。

模型管網分菌結果　　　　　　　　　　 表2

各菌株的生理生化特性　　　　　　　 　　　表3

2.1.2 透射電鏡
　　由于細菌個體較小，利用一般的光學顯微鏡觀察不夠清晰，為此，挑選幾種菌株拍攝了透射電鏡，它們的形態在本次分菌試驗中具有一定的代表性，本次試驗對玫瑰色微球菌、反硝化利斯特氏菌、節桿菌、擴展短桿菌進行透射電鏡拍攝觀察，結果見圖2所示。
　　從透射電鏡照片可以清楚地看到菌株單個細胞的形態及附屬物，細胞的組合方式等。圖2中的玫瑰色微球菌為球形，四聯排列；反硝化利斯特氏菌細胞幼菌為端圓短桿，老菌呈長桿狀，長有周生鞭毛；節桿菌老期培養物幾乎都是球狀菌，且大小不一 ，在較大的球狀細胞中，可能從細胞的兩個，三個或罕有從四個部位長出突起，該特點與《伯杰氏細菌鑒定手冊》對節桿菌的描述一致，是節桿菌鑒定的重要特征；擴展短桿菌幼菌呈長的不規則桿狀，單個或成對，老菌為球狀。

2.1.3 掃描電鏡
　　為了對管壁生物膜進行更直觀地觀察，于2005年3月對1號口進行取樣拍攝掃描電鏡，觀察管壁生物膜的生長情況電鏡照片如圖3所示。
　　從掃描電鏡照片中可以看出，管壁表面已經形成了管垢，管垢中有許多大小不均一的孔隙，為細菌的附著生長進而形成生物膜提供了條件，生物膜中附著有大量的球菌和桿菌及其菌膠團。這為致病菌的附著生長提供了很好的環境。管道中的水壓或水流流速變化使管壁上的生物膜被沖刷，就很容易導致水中細菌數增多及致病菌的爆發，因此該管道水存在細菌爆發的潛在危機。

2.1.4 PCR擴增結果
　　PCR擴增后的凝膠電泳照片如圖4所示。泳道1、2在II、III之間有一條特異擴增條帶，為陽性，其他樣品及空白泳道無條帶顯示，為陰性。實驗中特別設計了銅綠假單胞菌純菌樣品（T，由黑龍江省微生物研究所提供，菌株編號為ATCC 27853）同時進行實驗，為陽性結果，這就說明設計的引物對銅綠假單胞菌是具有特異擴增效果的，排除了其他樣品因非特異擴增而產生的陰性結果產生錯誤結論。從結果可以說明管道的幾個水樣R1、R2、M1、M2不存在銅綠假單胞菌。

2.2 試驗結果分析
　　從鑒定結果不難看出，從給水管壁生物膜中分離出的細菌均為化能異養菌，多為革蘭氏陽性菌，好氧或者兼性厭氧且桿菌較多。其中玫瑰色微球菌、藤黃微球菌、地桿菌屬、擴展短桿菌、節桿菌屬在管道模型三次試驗中均分離得到，說明這幾種菌在模型管道管壁的生物膜上一直存在，已經適應了管道的貧營養環境，是該次模型管道試驗的優勢菌。根據文獻[4]對這些優勢菌營養要求的描述，發現這兩種球菌的生長依賴于乙酸，乳酸鹽，丙酮酸鹽，琥珀酸鹽，甘油和碳水化合物（特別是葡萄糖）；這幾種桿菌的營養要求更為復雜，碳水化合物，糖類，脂肪酸，二羧酸，羥酸，乙二醇，氨基酸，雜環化合物等等都是它們能夠利用的營養物質。因此，從徹底去除細菌所需的營養物質角度來控制管道中的細菌再生長有一定的難度，需要在各個工藝上加強這些營養物質的去除效果。
　　從第三批經過增菌試驗的樣品共分出三種菌株，可以推斷這三種菌株在營養豐富的條件下繁殖較快，很快的在培養液里占據了優勢，而其他在不增菌條件下分離得到的其他菌株可能不適應富營養條件的培養液，被逐漸淘汰，因此未在增菌試驗的分菌試驗中得到。這些是只適應管道貧營養生長環境的菌種，在研究管道生物時應該予以重視。另外，擴展短桿菌在增菌或不增菌試驗中均存在，說明該菌的適應能力較強，既能適應管道的貧營養生長環境也能適應富營養生長環境。
　　從實際管網的分菌結果看出，實際管網管壁生物膜中生長的細菌種類與模型管道中的類似，由于模型管道與實際管網輸送的是同一水質的水，因此可以推斷長期輸送該水質管道的管壁上容易滋生這些類型的細菌。雖然這些細菌不是致病菌，但是管壁上大量細菌的附著與繁殖有利于某些機會病原菌的滋生，一旦管道中的水流速度、壓力發生變化沖刷管壁形成的生物膜就容易導致水中病原菌的爆發，危害人類健康。
　　從拍攝的模型管網掃描電鏡照片可以看出，管壁表面已經形成了管垢，管垢中有許多大小不均一的孔隙，為細菌的附著生長進而形成生物膜提供了條件，生物膜中附著有大量的球菌和桿菌及其菌膠團。這為致病菌的附著生長提供了很好的環境。管道中的水壓或水流流速變化使管壁上的生物膜被沖刷，就很容易導致水中細菌數增多及致病菌的爆發，因此該管道水存在細菌爆發的潛在危機。
　　從PCR擴增檢測銅綠假單胞菌的結果說明此次試驗的模型管網與實際管網中并不存在銅綠假單胞菌，目前較為安全。

3 結論

　　（1）從模型管網（運行一年）的掃描電鏡照片可以看出，管壁表面已經形成了管垢，管垢中有許多大小不均一的孔隙，為細菌的附著生長進而形成生物膜提供了條件，生物膜中附著有大量的球菌和桿菌及其菌膠團。這為致病菌的附著生長提供了很好的環境。管道中的水壓或水流流速變化使管壁上的生物膜被沖刷，就很容易導致水中細菌數增多及致病菌的爆發，因此該管道水存在細菌爆發的潛在危機。
　　（2）從鑒定結果不難看出，從給水管壁生物膜中分離出的細菌均為化能異養菌，多為革蘭氏陽性菌，好氧或者兼性厭氧且桿菌較多。其中玫瑰色微球菌、藤黃微球菌、地桿菌屬、擴展短桿菌、節桿菌屬在管道模型三次試驗中均分離得到，說明這幾種菌在模型管道管壁的生物膜上一直存在，已經適應了管道的貧營養環境，是該次模型管道試驗的優勢菌。
　?。?）根據這些優勢菌的營養要求，我們發現玫瑰色微球菌、藤黃微球菌的生長依賴于乙酸，乳酸鹽，丙酮酸鹽，琥珀酸鹽，甘油和碳水化合物（特別是葡萄糖）；地桿菌屬、擴展短桿菌、節桿菌屬的營養要求更為復雜，碳水化合物，糖類，脂肪酸，二羧酸，羥酸，乙二醇，氨基酸，雜環化合物等等都是它們能夠利用的營養物質。因此，從徹底去除細菌所需的營養物質角度來控制管道中的細菌再生長有一定的難度，需要在各個工藝上加強這些營養物質的去除效果。
　　（4）從第三批經過增菌試驗的分菌結果看出，共分出三種菌株，可以推斷這三種菌株在營養豐富的條件下繁殖較快，很快的在培養液里占據了優勢，而其他在不增菌條件下分離得到的其他菌株可能不適應富營養條件的培養液，被逐漸淘汰，因此未在增菌試驗的分菌試驗中得到。這些是只適應管道貧營養生長環境的菌種，在研究管道生物時應該予以重視。另外，擴展短桿菌在增菌或不增菌試驗中均存在，說明該菌的適應能力較強，既能適應管道的貧營養生長環境也能適應富營養生長環境。
　?。?）從實際管網的分菌結果看出，實際管網管壁生物膜中生長的細菌種類與模型管道中的類似，由于模型管道與實際管網輸送的是同一水質的水，因此可以推斷長期輸送該水質管道的管壁上容易滋生這些類型的細菌。雖然這些細菌不是致病菌，但是管壁上大量細菌的附著與繁殖有利于某些機會病原菌的滋生，一旦管道中的水流速度、壓力發生變化沖刷管壁形成的生物膜就容易導致水中病原菌的爆發，危害人類健康。
　?。?）從PCR擴增檢測銅綠假單胞菌的結果看出，此次試驗的模型管網與實際管網中并不存在銅綠假單胞菌，目前較為安全。PCR擴增方法簡便快速，可以針對某一菌種進行快速檢測，比起傳統的生物學方法具有很大的優越性，值得推廣。

參考文獻

[1] 李靈芝，李建渠，王占生 飲用水生物穩定性及影響因素 平頂山師專學報 2004，19（5）：34-36
[2] 馬群飛，林堅，陳美蘭，楊明金，阮國洪飲用天然礦泉水水源銅綠假單胞菌污染調查環境與健康雜志 2001，18（3）：157-159
[3] 馬放等編 污染控制微生物學實驗 哈爾濱工業大學出版社 2002
[4] R.E布坎南，N.E吉本斯等編 伯杰細菌鑒定手冊（第八版） 科學出版社 1984
[5] 李秀珠，蔡妙英 常見細菌系統鑒定手冊科學出版社 2001
[6] K.P.Song，T.K.Chan，Z.L.Ji，S.W.Wong. Rapid identification of Pseudonmonas aeruginosa from ocular isolates by PCR using exotoxin A-specific primers. Molecular and Cellular Probes （2000）14,199~204
[7] Ferenc Karpati，Jon Jonasson. Polymerase chain reaction for the detection of Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia and Burkholderia cepacia in sputum of patients with cystic fibrosis. Molecular and Cellular Probes（1996）10，397~403
[8] Gareth Lloyd-Jones，Andrew D.Laurie，Aynsley C.Tizzard. Quantification of the Pseudomonas population in New Zealand soils by fluorogenic PCR assay and culturing techniques. Journal of Microbiological Methods 60（2005），217~224
[9] Nicola M.Kingsoford，Herman W.Raadama. Detection of Pseudomonas aeruginosa from ovine fleece washings by PCR amplification of 16S ribosomal RNA. Veterinary Microbiology 47（1995），61~70

*通訊作者：于水利：Email:ysl@hit.edu.cn
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